增強(qiáng)子—啟動(dòng)子RNA鏈接圖 薛愿超供圖
人類基因組計(jì)劃研究表明,人類基因組中只有不到2%的蛋白質(zhì)編碼序列,而剩余98%為非編碼核酸序列。這些非編碼序列可能有功能,也可能僅僅是副產(chǎn)物,曾被稱為“垃圾DNA”或者“暗物質(zhì)”。
隨著認(rèn)識(shí)的深入,人們意識(shí)到,非編碼序列經(jīng)過廣泛轉(zhuǎn)錄后生成的大量非編碼RNA在個(gè)體生命中具有重要的生理調(diào)控功能。非編碼RNA有著怎樣的結(jié)構(gòu)?如何發(fā)揮功能?認(rèn)識(shí)這些,對(duì)于理解生命健康過程至關(guān)重要。
5月6日,《自然》刊發(fā)了中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所研究員薛愿超團(tuán)隊(duì)的最新成果。他們建立了能夠捕獲RNA原位高級(jí)結(jié)構(gòu)和作用靶標(biāo)的RIC-seq新技術(shù),并利用該技術(shù)首次在細(xì)胞內(nèi)全景式地捕獲RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及各種類型非編碼RNA的作用靶標(biāo),為RNA領(lǐng)域發(fā)展提供了全新的實(shí)驗(yàn)工具。
“高級(jí)”RNA有“魔力”
非編碼RNA在細(xì)胞中數(shù)量眾多、無處不在。如今諸多研究表明,它不再是無用的“垃圾”,反而處處“刷存在感”。
已有相關(guān)研究表明,非編碼RNA參與了胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、感染以及免疫應(yīng)答等幾乎所有生理或病理過程的調(diào)控,與惡性腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝疾病等相關(guān)的突變約90%定位在非編碼區(qū)。
論文通訊作者薛愿超告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》,與編碼蛋白質(zhì)的mRNA不同,雖然非編碼RNA也攜帶遺傳密碼,但是它們往往不具有蛋白質(zhì)編碼潛能。非編碼RNA的調(diào)控功能主要是通過形成高級(jí)結(jié)構(gòu),并在RNA結(jié)合蛋白的介導(dǎo)下與其他mRNA或者非編碼RNA相互作用而實(shí)現(xiàn)。因此,解析細(xì)胞內(nèi)RNA的原位高級(jí)結(jié)構(gòu)及相互作用靶標(biāo)是探究非編碼RNA功能機(jī)制的關(guān)鍵。
所謂高級(jí)結(jié)構(gòu),是指三級(jí)及以上的結(jié)構(gòu)?!斑^去,可能很多人認(rèn)為RNA僅僅是由A/U/C/G四種堿基所組成的線性序列,它的外觀是像意大利面一樣的條狀分子?!毖υ赋f。
事實(shí)上,RNA在細(xì)胞內(nèi)通過A—U、C—G或G—U配對(duì)先形成二級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而在RNA結(jié)合蛋白的協(xié)助下折疊成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
而特定的RNA分子在形成復(fù)雜的三級(jí)結(jié)構(gòu)后便具有了神奇的“魔力”,比如可以像蛋白質(zhì)一樣具有酶的催化活性。
上世紀(jì)80年代初,美國(guó)科學(xué)家托馬斯·切赫和西德尼·奧爾特曼正是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)具有催化活性的RNA分子而獲得1989年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
然而,在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)研究RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是RNA領(lǐng)域的世界性難題,難就難在利用現(xiàn)有的酶學(xué)和化學(xué)方法不能準(zhǔn)確解析遠(yuǎn)距離的、非互補(bǔ)配對(duì)的RNA—RNA相互作用。
此外,非編碼RNA發(fā)揮功能需要跟其他的RNA分子互作,這些互作被稱為“靶標(biāo)”。而只有準(zhǔn)確地鑒定靶標(biāo)才能推導(dǎo)非編碼RNA跟其他RNA分子作用的規(guī)律,以及作用后如何影響靶標(biāo)RNA的穩(wěn)定性、翻譯和定位等。
薛愿超表示,過去,我國(guó)在RNA結(jié)構(gòu)及相互作用的技術(shù)研發(fā)原創(chuàng)性方面有所欠缺,現(xiàn)有技術(shù)也存在一定的局限性,比如得到的單鏈和雙鏈信息不完整、在體外做近端連接假陽性率高等。
2015年,從美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校博士后出站,薛愿超入職中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所并建立實(shí)驗(yàn)室。那時(shí),他開始思考,是否能開發(fā)新技術(shù)來系統(tǒng)性地研究非編碼RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)和作用靶標(biāo)。
新技術(shù)實(shí)現(xiàn)“一網(wǎng)打盡”
2015年9月,薛愿超的第一位博士生、該研究的第一作者蔡兆奎進(jìn)入課題組,年輕的“師徒”開始攜手構(gòu)建理想中的新技術(shù)。
考慮到RNA結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外存在一定的差別,他們?cè)趯?duì)RIC-seq技術(shù)進(jìn)行原理性設(shè)計(jì)時(shí),重點(diǎn)突出了“原位”的概念。
“原位是指在保持細(xì)胞完整性的前提下,對(duì)所有空間上鄰近的RNA進(jìn)行近端連接、篩選和測(cè)序?!毖υ赋f。
任何新技術(shù)誕生后都需要做大量驗(yàn)證以確定其準(zhǔn)確度、可重復(fù)性和假陽性率。研究人員首先評(píng)估了RIC-seq技術(shù)的相關(guān)指標(biāo),比較和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明,與現(xiàn)有非編碼RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相比,RIC-seq技術(shù)均表現(xiàn)得更好。
此外,它還可“一網(wǎng)打盡”看清細(xì)胞內(nèi)各種RNA—RNA空間相互作用,包括以前看不到的RNA三級(jí)空間鄰近相互作用。
基于此,研究人員構(gòu)建了RNA三維作用圖譜,通過解析發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA在細(xì)胞內(nèi)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域和反式作用規(guī)律。
研究人員并未就此止步?!拔覀兿雵L試用RIC-seq技術(shù)來看看啟動(dòng)子RNA和增強(qiáng)子RNA之間是否存在互作。”薛愿超說。
基因什么時(shí)候表達(dá)、在什么組織里表達(dá),均由增強(qiáng)子和啟動(dòng)子控制。在一個(gè)細(xì)胞里,大概有5萬個(gè)啟動(dòng)子,而增強(qiáng)子至少有10萬個(gè),它們之間的對(duì)應(yīng)調(diào)控關(guān)系是現(xiàn)代生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
同時(shí),由于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)都可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA,且增強(qiáng)子和啟動(dòng)子在空間上鄰近配對(duì)后才能激活轉(zhuǎn)錄,這使得新開發(fā)的RIC-seq技術(shù)能夠派上用場(chǎng)。
令他們意外的是,研究表明,啟動(dòng)子RNA和增強(qiáng)子RNA之間確實(shí)存在相互作用?!?0%左右可以利用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,有意思的是,我們進(jìn)一步證明了增強(qiáng)子和啟動(dòng)子RNA之間的相互作用,這對(duì)染色質(zhì)構(gòu)象的形成和基因的激活很重要。”蔡兆奎說。
這也在國(guó)際上率先證明了啟動(dòng)子和增強(qiáng)子非編碼RNA之間的互作可用于推導(dǎo)其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RIC-seq技術(shù)被認(rèn)為是RNA結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)研究方面的一個(gè)飛躍?!叭绻fRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)研究方面我們處于跟跑狀態(tài),那么這次在RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)和靶標(biāo)研究方面,我們?cè)趪?guó)際上應(yīng)該算是處在領(lǐng)跑位置。”薛愿超說。
診療病毒新“利器”
艾滋病病毒、埃博拉病毒、禽流感病毒等均屬于RNA病毒,它們帶來的疾病正在全球肆虐,威脅人類健康。
薛愿超指出,利用RIC-seq技術(shù)能夠在病毒侵入人體細(xì)胞的過程中解析病毒RNA的結(jié)構(gòu)和靶標(biāo),這將有助于理解RNA病毒的致病機(jī)制。同時(shí),根據(jù)解析的結(jié)構(gòu),還可設(shè)計(jì)出更為有效的小干擾RNA來切割病毒,達(dá)到治療的效果。
此外,利用RIC-seq技術(shù)還可系統(tǒng)分析重大疾病相關(guān)突變對(duì)RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)和作用靶標(biāo)的影響,這將有望揭示非編碼區(qū)突變的致病機(jī)理,并為臨床診斷和治療奠定基礎(chǔ)。
不過,新技術(shù)應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。薛愿超表示,把RIC-seq技術(shù)得到的RNA空間位置信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暬腞NA高級(jí)結(jié)構(gòu)是當(dāng)前最大的挑戰(zhàn)。
“解決這一問題,需要與計(jì)算模擬和算法開發(fā)的專業(yè)團(tuán)隊(duì)合作。當(dāng)然,我們自己也在做各種嘗試,希望近幾年會(huì)有成果?!毖υ赋f。
下一步,他們希望從RNA結(jié)構(gòu)和相互作用的角度入手,探究非編碼區(qū)的疾病相關(guān)突變的致病機(jī)理,并對(duì)RNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域的功能機(jī)制等RIC-seq技術(shù)引出的科學(xué)問題進(jìn)行探索。